Czysto, czyściej, aseptycznie.

W celu uzyskania odpowiedniej jakości produktów producenci dostosowują się do wymogów stawianych przez GMP (good manufacturing practice). Jest to zestaw międzynarodowych standardów stosowanych w produkcji przemysłowej, gastronomii oraz innych obszarach działalności gospodarczej. Pierwsze standardy GMP wprowadzono w przemyśle farmaceutycznym. Aby produkt końcowy odpowiadał wymaganiom opracowano i wdrożono w życie odpowiednie zmiany w procesach wytwarzania. Oprócz zaleceń mikrobiologicznych dotyczą one również procedur zabezpieczenia przed błędami, odpowiedzialności, kompetencji, zasad utrzymania jakości czy dokumentacji. Zalecenia te mają charakter ogólnych dyrektyw, dlatego w praktyce zakładowej czy aptecznej wymagają opracowania dla konkretnego przypadku.

Proces mycia i dezynfekcji spełnia zasadniczą rolę w utrzymaniu ustalonych warunków higienicznych w każdym procesie wytwórczym. Usunięcie zanieczyszczeń fizycznych i chemicznych oraz mikroorganizmów z całej przestrzeni produkcyjnej jest środkiem i celem do utrzymania odpowiedniej jakości produkcji. Skuteczna dezynfekcja musi być poprzedzona czyszczeniem i myciem. Łączenie mycia i dezynfekcji skraca proces, choć może nie przynieść oczekiwanych rezultatów. Zbyt długie stosowanie jednego typu preparatów zawierających związki chemiczne należące do tej samej grupy może wzbudzać proces narastania oporności drobnoustrojów. W procesie produkcyjnym również woda i powietrze poddawane są dezynfekcji. Woda musi spełniać warunki stawiane wodzie pitnej lub do celów gospodarczych, zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia i Opieki Społecznej. Powietrze dezynfekowane jest tam, gdzie w trakcie procesu technologicznego półprodukt lub produkt ma bezpośredni kontakt z otoczeniem. Konieczny jest wówczas mikrobiologiczny monitoring stanu powietrza i dezynfekcja odpowiednią metodą.

Mycie urządzeń produkcyjnych

Czyszczenie – polega na usunięciu wszystkich zbędnych sprzętów oraz ewentualnym ich rozmontowaniu w celu pozbycia się brudu. Etap ten ma istotny wpływ na skuteczność i koszty mycia.

Odmianą czyszczenia jest czyszczenie kriogeniczne z wykorzystaniem stałego dwutlenku węgla. Obniżenie temperatury do kilkudziesięciu stopni poniżej zera, zmienia właściwości wielu substancji w tym białek i lipidów, powodując ich zwiększoną kruchość i łamliwość. Cząstki dwutlenku węgla są w tej metodzie zasysane pneumatycznie i rozdrabniane do wielkości kilku mikronów, a strumień ten jest kierowany pod ciśnieniem na czyszczoną powierzchnię. Wadą tej metody są stosunkowo wysokie koszty i duże natężenie hałasu podczas jej stosowania.

Płukanie wstępne – sprzyja mu podwyższona temperatura od 45 do 60ºC. Poniżej 45ºC nie rozpuszczają się lipidy, powyżej 60ºC denaturuje białko, co utrudnia jego usuwanie. Płukanie ułatwia podwyższone ciśnienie. Przy zbyt wysokim jego wzroście powstają jednak aerozole, które mogą po czasie osiadać na umytych powierzchniach, zanieczyszczając je wtórnie.

Mycie wodą z dodatkiem środków myjących – w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i kosmetycznym należy uznać ten etap za część procesu produkcyjnego.

Konieczne jest w tym procesie oderwanie cząstek brudu od powierzchni, również tych, które tworzą warstwę adhezyjną w postaci biofilmów. Wewnątrz biofilmu znajdować się bowiem mogą patogeny niewrażliwe na działanie środków myjących i dezynfekujących. Pozostawienie nie umytych powierzchni dłużej niż przez 8 godzin utrudnia usuwanie biofilmu i osłabia efekt dezynfekcji, gdyż jego tworzenie rozpoczyna się już w 10ºC po upływie tego czasu.

Warunkami sprzyjającymi tworzeniu biofilmu są zanieczyszczenia zawierające białka, kationy wapnia sieciujące polisacharydy oraz pH zbliżone do obojętnego, w którym rozwija się większość mikroorganizmów.

Skuteczne mycie może nastąpić tylko przy odpowiednio dużym nakładzie energii (mechanicznej, kinetycznej, termicznej, chemicznej) w określonym czasie. Źródłem energii może być skrobanie, szczotkowanie, ultradźwięki (20-40kHz), strumień roztworu myjącego, wzrost temperatury, zastosowanie odpowiedniego środka myjącego.

Dodatek surfaktantów czyli środków powierzchniowo czynnych ma na celu rozpuszczenie substancji nierozpuszczalnych bez dalszego podnoszenia temperatury. Im większy jest stopień zwilżalności powierzchni, tym większa jest zdolność związku powierzchniowo czynnego do penetracji zanieczyszczeń i ich emulgowania.

Płukanie pośrednie – każde mycie, niezależnie od rodzaju użytego środka powinno kończyć się spłukaniem powierzchni, co zapobiega późniejszym interakcjom ze środkami myjącymi.

Suszenie – powinno nastąpić niezwłocznie po zakończeniu płukania, tak aby nie rozcieńczać i nie zmniejszać tym samym stężenia środka dezynfekującego, który ma być następnie zastosowany.

Przeprowadzenie prawidłowo wszystkich etapów mycia pozwala na zmniejszenie od 100 do 1000 razy liczby drobnoustrojów na mytych powierzchniach.

Usuwanie drobnoustrojów

Sterylizacja, inaczej wyjaławianie jest procesem polegający na inaktywacji wszystkich form życia drobnoustrojów, w ich formach wegetatywnych lub przetrwalnikowych. Wyjaławianiu poddaje się ciała stałe, płynne i gazowe, dobierając metodę do właściwości materiału, który chcemy wyjałowić.

Środki antyseptyczne – hamują wzrost drobnoustrojów lub je zabijają bez uszkodzenia tkanek ludzkich. Stosuje się je miejscowo.

Środki dezynfekcyjne – zabijają drobnoustroje, lecz mogą uszkadzać tkanki ludzkie, dlatego stosowane są do przedmiotów. W zależności od rodzaju środka dezynfekującego działają one tylko na formy wegetatywne bakterii lub również na spory czy wirusy.

Chemiczne metody usuwania drobnoustrojów

Środki chemiczne przeciw drobnoustrojom dzielimy na:

powierzchniowo czynne:

kationowe – czwartorzędowe sole amoniowe, które łączą się z ujemnie naładowanymi błonami fosfolipidów, penetrując przez błonę prowadzą do zwiększenia jej przepuszczalności;
anionowe – mydła i kwasy tłuszczowe, które dysocjują w roztworze, przerywają błonę lipidową;
niejonowe – rozpuszczalniki organiczne – alkohole i fenole, działają również przez uszkodzenie błony komórkowej. Optymalne stężenie etanolu do celów dezynfekcyjnych wynosi 70%.

denaturujące:

denaturujące białko kwasy lub zasady – skrajne pH zaburza trójwymiarową strukturę białka, powodując jego denaturację;
metale ciężkie (np. srebro) – łączą się z grupami sulfhydrylowymi białek;
środki utleniające (np. nadtlenek wodoru) – działają zarówno na białka jak i na kwasy nukleinowe;
środki alkilujące (np. formaldehyd, tlenek etylenu) – denaturują białka i kwasy nukleinowe, powszechnie używane do odkażania narzędzi i powierzchni oraz sterylizacji niskotemperaturowej.

Wyjaławianie gazami stosuje się, gdy nie można zastosować innych metod, ze względu na to, że możliwa jest sorpcja gazów przez wyjaławiany materiał oraz reagowanie gazów z wytworzeniem związków toksycznych.

Środki chemiczne oznaczone są odpowiednimi piktogramami, po których można szybko określić, jakie zagrożenie niesie ze sobą postępowanie z danym środkiem.

Fizyczne metody niszczenia drobnoustrojów

Temperatura – w zależności od wysokości, jaką zastosujemy drobnoustroje ulegają całkowitemu spaleniu albo utlenieniu ulegną elementy wewnątrzkomórkowe, denaturacji ulegną białka, tworząc koagulaty, nastąpi rozerwanie nici kwasów nukleinowych.

Spalanie – tego typu metoda to np. wyżarzanie w płomieniu palnika. Wyjaławianie takie jest skutecznie stosowane przy niszczeniu skażonego materiału. Zapobiega rozprzestrzenianiu się drobnoustrojów poprzez całkowite zniszczenie.

Gorąca para wodna – prowadzi do hydrolizy ważnych dla życia struktur komórkowych. Wykonuje się ją w autoklawach wypełnionych gorącą parą wodną pod ciśnieniem, w temperaturze 121ºC, przez 15 minut. Niezbędnym warunkiem skuteczności jest usunięcie powietrza z komory sterylizacyjnej autoklawu przed rozpoczęciem właściwego procesu. Temperatura mieszaniny pary wodnej i powietrza jest zawsze niższa niż temperatura samej pary wodnej. Obecność powietrza wydłuża też czas potrzebny do zabicia drobnoustrojów.

W przypadku wyjaławiania płynów za pomocą autoklawu przyjmuje się, że płyn powinien zajmować nie więcej niż 85% objętości pojemnika, w którym podlega wyjałowieniu. Podczas ogrzewania hermetycznie zamkniętego opakowania z roztworem wytwarza się nadciśnienie, którego wielkość zależy od stopnia wypełnienia. Zbyt duża ilość płynu wewnątrz stwarza ryzyko rozerwania pojemnika. Bezzasadne jest wyjaławianie zamkniętych pustych butelek tą metodą, gdyż to nasycona para wodna warunkuje działanie wyjaławiające w hermetycznie zamkniętym pojemniku.

W autoklawie nie powinno się wyjaławiać olejów i innych płynów, które nie są układami wodnymi.

Suche gorące powietrze – wyjaławianie tą metodą prowadzi się w zamkniętych komorach zwanych sterylizatorami powietrznymi. Odpowiednio długi czas konieczny do wyjałowienia przy danej temperaturze określa Farmakopea. Suche gorące powietrze wolno penetruje, dlatego czas ten jest stosunkowo długi. Liczony musi być od osiągnięcia określonej temperatury wewnątrz sterylizatora. Parametry zależne są oczywiście od rodzaju materiału poddawanego sterylizacji. Zaletą tej metody jest to, że nie koroduje metali i nie wpływa na powierzchnie szklane.

Pasteryzacja – umiarkowana temperatura prowadzi do zmniejszenia lub usunięcia wegetatywnych form drobnoustrojów. Stosowana głównie w przemyśle spożywczym.

Promieniowanie – energia elektromagnetyczna o określone długości fali powoduje jonizację wody w cytoplaźmie prowadząc do tworzenie wolnych rodników, które uszkadzają kwasy nukleinowe i białka. Krótsze długości fal mają silniejsze właściwości bakteriobójcze.

Dezynfekcja powierzchni produkcyjnych.

Promieniowanie UV jest emitowane sztucznie przez lamy rtęciowe. Stosowane jest do dezynfekcji powierzchni urządzeń produkcyjnych, narzędzi, opakowań foliowych, tekturowych, dezynfekcji ścian, sufitów, powierza. Duża jest aktywność bójcza w zakresie fal 240-280nm, szczególnie 254nm. Działa letalnie na formy wegetatywne i przetrwalniki bakterii oraz wirusy. Dezynfekcja właściwa za pomocą UV zachodzi poprzez zmiany fotochemiczne w kwasach nukleinowych. Zasady pirymidynowe i purynowe, aminokwasy aromatyczne białek, silnie pochłaniają promieniowanie UV. Poszczególne grupy drobnoustrojów wykazują różną aktywność na działanie UV, najbardziej wrażliwe są formy wegetatywne. Wartość dawki niezbędnej do redukcji liczby żywych komórek w populacji określonych drobnoustrojów o 90% wyrażana jest w mJ/cm2, jako wielkość dawki naświetlenia. Skuteczność działania UV jest mniejsza w stosunku do bakterii wytwarzających żółte i czerwone barwniki oraz zabarwionych zarodników grzybów pleśniowych. Największą wrażliwość wykazują zwykle komórki w fazie wzrostu logarytmicznego, w temperaturze 27-40ºC oraz przy względnej wilgotności powietrza 30-70%. UV rozprasza się i jest mniej skuteczne w pomieszczeniu zawierającym kurz lub bardzo wilgotnym.

Dezynfekcja powietrza.

Powietrze dezynfekuje się najczęściej za pomocą promieniowania UV lub preparatów chemicznych.

Prowadzi się ją najczęściej w pomieszczeniach szpitalnych – salach operacyjnych lub gabinetach zabiegowych. W przemyśle dezynfekcję powietrza stosuje się wewnątrz instalacji wentylacyjnych, klimatyzacji lub do higienizacji powietrza w przestrzeniach produkcyjnych.

Skuteczność promieniowania maleje w miarę oddalania się od źródła promieniowania UV. Dawka bójcza jest zależna wprost proporcjonalnie do czasu naświetlania. Stosowane mogą być lampy bakteriobójcze odkryte, służące do jednoczesnej dezynfekcji powierzchni i powietrza. Lampy bakteriobójcze przepływowe mają zabudowane promienniki i służą wyłącznie do dezynfekcji powietrza. Mogą być wbudowane w ścianę lub przenośne. Skuteczny czas pracy promiennika wynosi od 2500-8000 godzin, po tym czasie moc lampy zmniejsza się do 80%. Dlatego konieczne jest prowadzenie ewidencji czasu pracy lampy UV.

Ultradźwięki – fale w górnym zakresie słyszalności oraz ultradźwięki rozbijają komórki.

Filtracja – jest to wyjaławianie przez sączenie. Najczęściej stosowane są sączki membranowe o porach 0,22μm lub mniejszych. Ich zaletami jest to, że nie zmieniają pH i nie adsorbują sączonego roztworu, mogą być stosowane do filtracji płynów termolabilnych, nie wypłukują niepożądanych substancji z przegrody sączącej. Usunięcie drobnoustrojów polega na zatrzymaniu ich na sączku. Należy pamiętać o użyciu jałowego zestawu sączącego i jałowego odbieralnika.

Sączenie wyjaławiające odbywa się w specjalnie do tego skonstruowanych zestawach. Bardzo duże objętości w przemyśle sączone są za pomocą urządzeń wielowarstwowych. W produkcji aptecznej stosuje się gotowe sączki membranowe nakładane na strzykawkę. Ma to szczególne zastosowanie do sączenia preparatów biologicznie czynnych i termolabilnych, na przykład witamin.

Wyjaławianie powietrza za pomocą filtrów HEPA – High Efficiency Particulate Air.

Stosuje się w przestrzeniach produkcyjnych, gdzie konieczne jest spełnienie rygorów aseptyki. Filtry takie wykonane są z włókien szklanych, o średnicy 0,1μm, ułożone wielowarstwowo, z pofałdowaną płytą sączącą. Ma to na celu zwiększenie do maksimum powierzchni sączącej. Powszechnie filtry tego typu wbudowywane są w loże laminarne lub stosowane do boksów aseptycznych, tak aby zapewnić odpowiednią klasę czystości powietrza w miejscu przygotowywania leku do podania pozajelitowego.

Do pracy w przestrzeniach o wysokiej klasie czystości powietrza (A lub B), znalazły zastosowanie izolatory. Tworzą one miejsce, gdzie praca odbywa się w warunkach całkowicie izolowanych od otocznia. Wykorzystywane są na przykład przy produkcji leków cytotoksycznych.

Istotną kwestią jest kontrola skuteczności dezynfekcji i sterylizacji przy użyciu dostępnych metod. Wykorzystać można w tym celu wskaźniki fizyczne (termometry, manometry), chemiczne (indykatory, paski wskaźnikowe), biologiczne (posiewy, wskaźniki biologiczne). Prowadzenie dokumentacji procesów wyjaławiania oraz badań kontrolnych pozwala na utrzymanie czystości mikrobiologicznej na odpowiednio wysokim poziomie.

Wyjałowione materiały muszą być też odpowiednio przechowywane, aby nie uległy ponownemu skażeniu. Prawidłowo zamknięte za pomocą zgrzewu materiały w opakowaniach typu folia-papier zachowują ważność minimum dwa lata. Przechowywanie tego typu opakowań musi mieć miejsce w pomieszczeniach suchych i o stałej temperaturze.

Zastosowanie się do wymogów GMP i utrzymywanie reżimu sanitarnego, zarówno na poziomie apteki jak i przemysłu, pozwala na utrzymanie odpowiednio wysokiej jakości i powtarzalności produkcji.

mgr farmacji Agata Luboińska

specjalista farmacji klinicznej

Fot. Fotolia.pl

Piśmiennictwo:

Farmakopea Polska X
Janicki S., Fiebig A., Sznitowska M., Farmacja stosowana, Wydawnictwo PZWL,Wydanie IV, Warszawa 2008, s.131-150
Libudzicz Z., Kowal K., Żakowska Z., Mikrobiologia techniczna mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcji żywności, tom 2, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009, s. 399-470
Luce-Wunderle G., Debrand-Passard A., redaktor wydania polskiego Łukieńczuk T. Pielęgniarstwo operacyjne, Elsevier Urban &Partner, Wrocław, 2006, s 2-4, s. 49-68
Parnowska W. Mikrobiologia farmaceutyczna problemy produkcji i kontroli leków, Wydawnictwo Lekarski PZWL, Warszawa 1998, s 13-54
Virella G, wydanie polskie pod redakcją Heczko P., Mikrobiologia i choroby zakaźne, Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, Wrocław 2000, 65-67
http://www.who.int/medicines/areas/quality_safety/quality_assurance/production/en/, 15.06.16
http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/vol-4/index_en.htm, 15.06.16